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揭示新发突发病毒感染机制 保障病毒疫情预判防控——中国科学院微生物研究所施一研究员

2017-09-13

 

中国科学院微生物所施一研究员长期从事结构生物学研究,着重关注流感、埃博拉和寨卡等新发突发病毒的跨种间感染人机制。在高福院士团队工作期间,他在埃博拉病毒研究方面,阐明了埃博拉病毒入侵宿主细胞的分子机制,率先从分子水平证实了第五种病毒膜融合激发机制的存在,并提供了抗病毒药物设计的新靶点,该成果入选2016年度中国生命科学领域十大进展之一。流感病毒研究方面包括高致病性H5N1亚型禽流感病毒和2013年暴发的H7N9亚型禽流感病毒,以及引起1918和2009两次大规模流行的人流感病毒和蝙蝠分离的流感病毒。通过生物物理技术等手段阐明了流感病毒的宿主特异性和禽流感病毒跨越种间障碍感染人的分子机制,尤其是阐明了高致病性H5N1禽流感病毒实现跨种间传播和H7N9禽流感病毒跨宿主感染人的分子机制,为流感疫情科学预判和科学防控提供了重要的理论基础。该成果与其他相关重要成果一起入选2013年中国十大科技进展之一。

一、揭示H5N1和H7N9等禽流感病毒跨种传播的分子机制

流感病毒跨种间传播机制研究是流感疫情科学预判和科学防控的基础。流感病毒的天然宿主是野生鸟类,通过家禽和家畜的媒介作用,流感病毒能够从野生鸟类传播到人类社会。而这个跨种间传播过程是由流感病毒的宿主嗜性决定的,如果流感病毒的宿主嗜性发生改变,它们就能够跨物种进行传播。影响宿主嗜性的因素很多,流感病毒血凝素蛋白(HA)与宿主受体结合的特异性就是其中关键因素之一。施一研究员利用生物物理技术、分子生物学技术等手段对H5N1和H7N9禽流感病毒的受体结合特性进行了系统研究。

目前认为,高致病性H5N1禽流感病毒的宿主被限制在禽类当中,偶发性感染人类。美国和荷兰科学家在H5蛋白上引入了几个氨基酸突变,就使得H5N1禽流感病毒突破种间屏障,在哺乳动物模型雪貂中通过空气传播。但是,H5N1禽流感病毒实现跨种间传播的分子机制却尚未清楚。为了回答这个科学问题,施一研究员利用晶体学方法解析高致病性禽流感H5N1病毒的野生型和突变型HA蛋白分别与禽源和人源受体类似物的复合物结构,揭示了突变型HA与人、禽受体结合的特点以及结构基础,发现关键的Q226L氨基酸突变决定了受体结合特性转换并进一步阐明了这种转换机制。该研究在分子水平对重要氨基酸突变能够导致H5N1病毒在哺乳动物间获得空气传播能力这一重要现象进行解析,是禽流感跨种间传播研究领域的重要突破,在国际期刊《科学》上发表。

2013年2月底暴发的人感染H7N9禽流感病毒于上海和安徽两地率先发现。该病毒感染禽类并不致病,而感染人却会引起严重呼吸道疾病。截至当前,H7N9感染人数已超过1300例,致死率为30%左右,病例主要分布于我国沿海一带城市。为了能有效地进行H7N9禽流感的防控,有几个问题急需得到回答。第一,H7N9禽流感病毒为何会跨种感染人?第二,H7N9禽流感病毒是否会造成大面积人际传播?第三,究竟哪个关键氨基酸突变导致宿主范围的改变?

围绕上述三个关键问题,施一研究员展开了一系列研究。通过比较分析H7N9亚型流感暴发事件中的流行毒株——安徽株(A/Anhui/1/2013)和非流行毒株——上海株(A/Shanghai/1/2013),来探索H7N9禽流感病毒感染人的分子机制。施一研究员阐明安徽株由于获得人源受体的结合能力,使得该毒株能够有效感染人群。通过进一步的结构基础研究,发现与之前报道的H5N1病毒不同,Q226L氨基酸突变对于H7N9病毒的表面血凝素蛋白(HA)获得人源受体结合能力不是唯一关键位点,受体结合位点的其它相关氨基酸也至关重要。此外,由于H7N9禽流感病毒依然保留了很强的禽源受体结合能力,所以其传播能力较为有限,不能造成大面积人际传播。该成果在国际期刊《科学》上发表。

施一研究员也对1918年和2009年大流行流感病毒D225G突变体的受体结合特性和分子基础进行了研究。2009年的甲型H1N1流感病毒在流行后期,其HA受体结合位点出现了D225G突变,并与致死性有很大相关性,而该突变也在1918年的大流感毒株出现。通过对野生型HA及其突变体的受体结合特性分析发现,野生型HA偏好性结合人源受体,而突变体HA既结合人源受体,又结合禽源受体。这种受体结合特性的转变,使得突变体病毒更易于进入肺等下呼吸道,从而与H5N1和H7N9亚型禽流感病毒类似,引发比较严重的疾病。同时利用结构生物学技术,阐明了受体结合特性发生改变的分子机制,并对不同氨基酸突变引起H1亚型HA的受体结合特性发生转变进行了总结。该成果在病毒学领域学术期刊Journal of Virology上发表。

此外,施一研究员还对蝙蝠来源的新亚型流感病毒H17N10的HA蛋白进行了结构和功能分析,发现H17的整体结构与经典的HA蛋白类似,但是受体结合位点却带负电荷,使得H17不结合经典的唾液酸受体。H17的特殊性质暗示流感病毒存在第二受体,并且极可能是蛋白质,而不是已知的糖类分子。该成果在国际学术期刊Cell Reports上发表。

在系列工作基础上,他受国际期刊Nature Reviews Microbiology邀请撰写综述文章,系统地归纳和总结了流感病毒跨种间传播的结构基础和传播规律,结合自身以及其它课题组所做的工作,在晶体结构的基础上解读了甲型流感病毒从禽类“跳跃”到人类的分子机制,为流感病毒的防控提供了必要的理论基础。

二、揭示了埃博拉病毒的入侵宿主细胞的分子机制

埃博拉病毒是引起人类和灵长类动物发生病死率极高的埃博拉病毒病的生物安全等级第四级(Biosafety Level 4)烈性病毒。埃博拉病毒作为一类囊膜病毒,其对宿主的感染过程起始于其对宿主细胞的入侵过程,这个过程也是设计抗病毒手段的重要靶点。埃博拉病毒的入侵过程可以分成两个重要步骤,首先是病毒粘附到宿主细胞膜表面,接着是病毒通过细胞内吞进入细胞内部,并形成内吞体,在内吞体里,病毒发生膜融合过程,释放自身遗传物质。前人研究发现内吞体膜上的C 型尼曼匹克蛋白 1(NPC1)分子是埃博拉病毒入侵所必须的,但是NPC1分子如何介导病毒入侵却一直是个未解之谜。

NPC1分子是负责胆固醇转运的多次跨膜蛋白,具有三个大的腔内结构域(A,C和I)。埃博拉病毒囊膜表面糖蛋白在内吞体里会经过宿主蛋白酶Cathepsin的酶切处理,变成激活态糖蛋白,暴露出受体结合位点来与NPC1分子的腔内结构域C发生相互作用,从而启动后续的病毒膜融合过程,实现病毒的感染生活史。施一研究员解析了NPC1分子的腔内结构域C的三维结构,并进一步突破性地解析了激活态糖蛋白与腔内结构域C的复合物三维结构,发现结构域C主要利用两个突出来的环状结构插入激活态糖蛋白头部的疏水凹槽里,从而发生相互作用。这个重要发现预示着能够针对激活态糖蛋白头部的疏水凹槽设计小分子或多肽抑制剂,来阻断埃博拉病毒的入侵过程。进一步的分析发现,激活态糖蛋白与腔内结构域C结合后,会发生构象变化,使得糖蛋白的融合肽更容易暴露出来,插入内吞体膜上,从而启动膜融合过程。这种新型病毒膜融合激发机制与之前病毒学家们熟知的四种病毒膜融合激发机制都大为不同,施一研究员从分子水平证实了第五种病毒膜融合激发机制的存在,这是病毒学领域的一大突破。该成果在国际学术期刊Cell上发表。

三、寨卡病毒的药物靶点研究

寨卡病毒属黄病毒科黄病毒属,是一种可以通过蚊子进行传播的虫媒病毒。寨卡病毒感染可以导致胎儿和新生儿小头症、格林巴利综合症、雄性睾丸损伤等,给人类造成了严重的威胁。寨卡病毒共编码10种蛋白,结构蛋白(C, PrM/M和 E),非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B和NS5),其中非结构蛋白NS1是病毒唯一分泌并与宿主相互作用的重要蛋白,在病毒复制、病理及免疫逃逸中起着关键作用。 NS2A-NS5六种非结构蛋白组成寨卡病毒复制中心复合体,对病毒的复制转录至关重要。

施一研究员率先解析了寨卡病毒非结构蛋白NS1的C端三维结构,发现其形成棒状的同源二聚体结构,一面由20个反平行的β折叠形成梯形结构,另一面由复杂的环状结构组成。与同属的西尼罗病毒(WNV)和登革病毒(DENV)的NS1蛋白结构相比,寨卡病毒NS1的整体结构很相似,但是在环状结构表面却存在不同的表面电荷分布特征。DENV I型和II型的NS1在环状结构表面的中心区域呈现正电荷分布,WNV的NS1则呈现负电荷分布,而寨卡病毒的NS1则既有正电荷又有负电荷。此区域正是位于NS1六聚体桶状结构的外侧,完全暴露在外面,为NS1与宿主相互作用的主要界面,也是抗体靶向的关键区域。此区域不同的表面电荷分布特征极有可能与不同黄病毒的致病模式不同有关,提示我们应该从NS1着手去研究其与小头畸形症、神经系统并发症的关系。该成果发表在国际学术期刊Nature Structural & Molecular Biology上。

随后,施一研究员解析了寨卡病毒NS1全长蛋白的晶体结构。NS1存在结构不同的两个面,内表面和外表面,分别面对病毒的复制系统和宿主的免疫系统,以此实现蛋白的两个主要功能。在寨卡病毒NS1结构的内表面有一个长的缠绕loop可以形成疏水的“spike”,可以插入细胞膜中,参与膜结合。这个疏水loop的存在对于病毒复制以及NS1分泌到细胞外引起宿主发病具有重要作用,因此NS1可以作为一个新的药物靶点。该成果发表在国际学术期刊EMBO Journal上。

由多种非结构蛋白组成的寨卡病毒复制中心复合体对寨卡病毒复制与转录具有重要作用,因此开发抑制重要病毒蛋白活性、进而阻止病毒复制和存活的抗病毒药物也是非常重要的方向。在寨卡病毒复制中心中,非结构蛋白NS5是寨卡病毒分子量最大、最保守的蛋白。NS5蛋白由两个结构域组成:甲基转移酶(MTase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),分别具有两个关键的酶活性:甲基转移酶活性和聚合酶活性。这两种活性对于病毒的复制至关重要,因此NS5是开发抗病毒药物非常理想的靶点。施一研究员解析了寨卡病毒NS5甲基转移酶与甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的复合物结构,MTase与SAM及RNA类似物的(m7GpppA)的三元复合物结构,以及NS5 RdRp的晶体结构。施一研究员发现NS5的MTase和RdRp结构都较为保守,提示我们当前基于登革病毒和西尼罗病毒等其它黄病毒NS5开发设计的抗病毒药物可能对寨卡病毒依旧有效。同时,寨卡病毒NS5的结构解析也为基于结构的抗寨卡病毒药物设计和优化提供了基础。该成果发表于国际学术期刊EMBO Journal

四、致力于寨卡、埃博拉和流感等新发突发病毒的复制机理研究

现有证据表明,可引起人类疾病的流感、埃博拉和寨卡等新发突发病毒均为动物源性,通过跨种间传播感染人。例如,流感病毒的天然宿主是野生鸟类,埃博拉病毒的天然宿主是蝙蝠,而寨卡病毒则来源于猴子,通过蚊子进行传播。而这些新发突发病毒如何突破种间屏障来感染人是科学界和公众都极其关注的科学问题。病毒的复制周期可以分成3个主要步骤,入侵、复制、组装与释放。病毒的跨种间感染是相当复杂的一个事件,与病毒复制周期的每一步过程都息息相关。截至目前,学界对于寨卡和埃博拉病毒复制过程的认识仍相当浅显,决定病毒复制过程的聚合酶及其复制相关蛋白的结构基础和分子特征都不清楚。而流感病毒又可分成4个不同型别,甲型、乙型、丙型和最近发现的丁型,虽然目前对于甲型、乙型和丙型的聚合酶复合物的结构基础有所了解,但是聚合酶复合物如何行使病毒基因组复制和转录双功能的调控机制依然未搞清,还有丁型流感病毒的聚合酶复合物的结构基础依然未知,需要进行系统性比较研究。

在前期流感和埃博拉等新发突发病毒入侵机制相关研究的基础上,施一研究员建立自己的研究团队后,将致力于进一步对新发突发病毒的跨种间传播机制研究,从“表面”扩展到“内部”,以寨卡、埃博拉和流感等新发突发病毒聚合酶及其病毒复制相关蛋白的功能和结构特征为切入点,系统性地研究新发突发病毒在宿主细胞内部的复制机理,为有效防控新发突发病毒跨种间感染事件提供理论基础和指导。该项目以结构生物学为基础,辅以生物化学、生物物理和细胞生物学等实验方法和手段,对寨卡、埃博拉和流感等新发突发病毒聚合酶及其复制相关蛋白的结构功能进行系统性的深入研究。研究成果可以为有效地防控流感、埃博拉和寨卡等新发突发病毒提供科学依据,具有重要的公共卫生意义。主要靶向寨卡、埃博拉病毒聚合酶蛋白和复制相关蛋白的整体结构特征和各亚基的空间排布方式,以及流感病毒聚合酶复合物实现病毒基因组复制和蛋白转录表达双功能的调控机制,具有重要的基础科学研究意义。深入认识这些新发突发病毒聚合酶蛋白及其复制相关蛋白的结构和功能,并在此基础上进一步研发抗病毒药物,对于应对新发突发病毒跨种间传播事件,进而形成有效的防控和治疗策略具有重要的科学与现实意义。

专家简介

   施一,博士,1985年生。中国科学院微生物研究所研究员,博士生导师,获国家优秀青年科学基金项目资助,中国科学院青年创新促进会会员,曾获首届“中源协和生命医学创新突破奖”、中国科学院“卢嘉锡青年人才奖”,并荣获中国科学院卓越青年科学家项目资助。主持国家自然科学基金项目2 项,主持国家973计划项目子课题1项。主要研究方向包括病原感染调控的分子机制研究和免疫细胞受体与配体相互作用及其识别机制。目前已在CellScience等国际学术期刊发表SCI论文50余篇。